La scintilla di zinco è una firma inorganica dell'attivazione dell'uovo umano

Paramahansa Yogananda, nei suoi commenti alla Bhagavad Gita, scrisse: “Durante l’unione dello spermatozoo con l’ovulo, che causa l’inizio della formazione di un nuovo corpo fisico umano, appare un raggio di luce nel mondo astrale [...]. Questa luce trasmette un modello che attrae un’anima in accordo con il karma da essa posseduto, cioè l’influenza autocreata determinata dalle azioni di vite passate.”
"L'avventura comincia con la lotta che l'anima deve sostenere per entrare nell'utero materno al momento del concepimento. [...]
Ci sono milioni di anime che lottano per ritornare sulla terra, per entrare nelle cellule unite dello spermatozoo e dell'ovulo nel momento del concepimento. [...] Al momento del concepimento si produce un lampo nell'etere e un'anima entra nelle cellule congiunte dello spermatozoo e dell'ovulo. Voi avete dovuto lottare per guadagnarvi l'accesso al grembo materno.
Non solo voi, ma molte altre anime si sono precipitate per entrare, e quelle che hanno vinto la corsa siete io e voi. Non è stata una vittoria facile."
P. Yogananda, L'eterna ricerca dell'uomo, Astrolabio.

La scintilla di zinco è una firma inorganica dell'attivazione dell'uovo umano

L'attivazione dell'uovo si riferisce agli eventi necessari per la transizione di un gamete in un embrione, compreso l'instaurarsi del blocco polispermico, il completamento della meiosi, l'ingresso nella mitosi, il reclutamento selettivo e la degradazione dell'mRNA materno e lo sviluppo pronucleare. 

Qui mostriamo che i flussi di zinco accompagnano l'attivazione dell'uovo umano. Abbiamo monitorato le dinamiche di calcio e zinco nelle singole uova umane utilizzando fluorofori selettivi dopo l'attivazione con calcio-ionomicina, ionomicina o microiniezione di cRNA hPLCζ. 

Questi metodi di attivazione delle uova, come previsto, hanno indotto aumenti dei livelli di calcio intracellulare e hanno anche innescato il rilascio coordinato di zinco nello spazio extracellulare in una prominente "scintilla di zinco". La capacità del gamete di montare una risposta alla scintilla di zinco dipendeva dallo stadio meiotico. Inoltre, la sola chelazione dello zinco intracellulare era sufficiente per indurre la ripresa del ciclo cellulare e la transizione di una cellula meiotica in una mitotica. Insieme, questi risultati dimostrano funzioni critiche per la dinamica dello zinco e stabiliscono la scintilla di zinco come marcatore extracellulare del primo sviluppo umano.

introduzione

Una finestra critica dello sviluppo iniziale è l'attivazione dell'uovo, una sequenza di eventi che segna la transizione di un uovo maturo in un embrione in via di sviluppo 1 . 

Questi eventi comprendono il blocco della polispermia, il completamento della meiosi, il reclutamento dell'mRNA materno e la formazione del pronucleare 1 . Distinti modelli transitori di calcio citoplasmatico nell'uovo innescati da fattori di attivazione degli ovociti derivati ​​dallo sperma - come la fosfolipasi C (PLCζ) - al momento della fecondazione determinano eventi specifici dell'attivazione dell'uovo 2 . 

È interessante notare che specifici profili transitori di calcio prodotti dallo zigote sono altamente associati alla qualità dell'embrione 3 , 4 , 5 , 6. Inoltre, l'alterazione del pattern naturale dei transitori di calcio nello zigote può avere effetti a lungo termine sull'espressione genica nell'embrione e sullo sviluppo della prole7 . Sebbene i modelli transitori di calcio nell'uovo siano altamente indicativi dei risultati dello sviluppo, il monitoraggio di questi transitori richiede coloranti di imaging intracellulare e quindi proibisce l'applicazione clinica di questa lettura biologica.

Recentemente, noi e altri abbiamo dimostrato in specie di roditori, suini e primati non umani che lo zinco è un altro elemento essenziale coinvolto nella meiosi e nell'attivazione delle uova 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Nel topo, la maturazione meiotica - o la progressione del gamete da una cellula arrestata nella profase della meiosi I in un uovo maturo arrestato nella metafase della meiosi II - è accompagnata da un aumento sostanziale (50%) del contenuto totale di zinco necessario per progressione meiotica corretta 11. Alla fecondazione, tuttavia, i livelli totali di zinco devono diminuire e, entro pochi minuti dalla fecondazione, lo zinco viene rilasciato dallo zigote in un evento secretorio chiamato "scintilla di zinco" 10 , 16 . Fisiologicamente, questo rilascio di zinco segue da vicino i transitori del calcio ed è necessario per la ripresa del ciclo cellulare attraverso percorsi che includono la modulazione della proteina regolatrice del ciclo cellulare EMI29,17 . 

Il trattamento delle uova di topo con un chelante di zinco permeabile alla membrana riduce la disponibilità di zinco intracellulare ed è sufficiente per indurre l'attivazione dell'uovo 10 , 11 , 17. Inoltre, si può ottenere una progenie viva e fertile quando embrioni diploidi generati mediante iniezione di teste di spermatozoi inattivati ​​seguiti da trattamento chelante dello zinco vengono trasferiti ai topi riceventi e ciò avviene in completa assenza di oscillazioni del calcio 17 . 

Questi risultati suggeriscono che la regolazione precisa dello zinco da sola è sufficiente per controllare gli eventi di attivazione delle uova e lo sviluppo dell'embrione. 

Pertanto, il profilo della scintilla di zinco di uno zigote può essere un marcatore extracellulare precoce del suo potenziale di sviluppo e la modulazione dello zinco può essere un prezioso strumento clinico.

La nostra comprensione del ruolo dello zinco durante l'attivazione dell'uovo è stata limitata agli studi su organismi modello perché i momenti successivi all'attivazione dell'uovo umano rappresentano un momento privilegiato rispetto alla scienza di base. Le significative lacune nella conoscenza dei primi eventi di sviluppo nella nostra specie derivano sia dalla natura rara e unica dell'uovo umano sia dalle restrizioni etiche e legali che circondano gli studi che coinvolgono la partenogenesi o la fecondazione 19 , 20 , 21 . Abbiamo dimostrato in precedenza che le uova umane contengono trasportatori di zinco e vescicole di zinco arricchite corticamente, suggerendo che lo zinco può avere un ruolo di primo piano durante l'attivazione dell'uovo umano 10 , 13 , 16. L'obiettivo di questo studio era di estendere la nostra conoscenza della scintilla di zinco dagli organismi modello all'uomo. Utilizzando tre metodi indipendenti di attivazione dell'uovo (ionomicina di calcio, ionomicina e hPLCζ cRNA), definiamo il flusso di zinco come una firma inorganica della transizione uovo-embrione umano e dimostriamo che la chelazione dello zinco intracellulare da sola induce l'attivazione dell'uovo. Questi esperimenti non solo definiscono ulteriormente la biologia fondamentale dell'attivazione dell'uovo umano, ma gettano anche le basi per l'applicazione clinica del flusso di zinco per decodificare il profilo della scintilla di zinco extracellulare come lettura del potenziale del gamete e per sviluppare la chelazione dello zinco come metodo di attivazione.

Risultati

Le scintille di zinco sono associate all'attivazione partenogenetica

Nel topo, l'attivazione di uova mature arrestate in metafase II (MII) (di seguito denominate uova) mediante fecondazione o mezzi chimici stimola l'esocitosi dello zinco dalle vescicole arricchite nella corteccia dell'uovo, rappresentando una perdita di circa il 20% dello zinco contenuto della cellula e tali scintille di zinco sono state documentate anche in due specie di primati non umani 10 , 16 . Per esaminare se la perdita di zinco si verifica durante l'attivazione dell'uovo umano, abbiamo prima trattato le uova umane con lo ionoforo di calcio, Ca-ionomicina, che fornisce un bolo di calcio esogeno direttamente nell'uovo e bypassa le cascate di segnalazione indotte dallo sperma necessarie per suscitare un aumento in depositi endogeni di calcio intracellulare 22. Abbiamo quindi monitorato la dinamica del calcio intracellulare e dello zinco extracellulare nelle singole uova mediante imaging di cellule vive utilizzando rispettivamente i coloranti Fluo-4-AM e FluoZin-3. Lo zinco è stato rilasciato dalla periferia dell'uovo umano in modo coordinato con l'aumento del calcio intracellulare entro pochi secondi dall'esposizione a 20 μM di Ca-ionomicina, ( Fig. 1A, B , Movie S1 ). Esisteva una correlazione positiva tra la scintilla di zinco e il transitorio di calcio, con un'onda di calcio intracellulare più grande associata a una maggiore ampiezza di esocitosi di zinco ( Fig. 1C). Inoltre, abbiamo convalidato la scintilla di zinco indotta dall'attivazione dell'uovo utilizzando due approcci aggiuntivi che stimolano il rilascio di depositi endogeni di calcio, tra cui ionomicina (forma apo, senza Ca) e microiniezione di cRNA umano PLCζ (hPLCζ). La PLCζ specifica per il maschio ricapitola le oscillazioni del Ca 2+ indotte dagli spermatozoi generando inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3 ) dall'idrolisi del fosfatidilinostitolo (4,5)-bisfosfato. Questa reazione sostiene il coinvolgimento del rilascio di Ca 2+ mediato da IP 3 dai depositi intracellulari nella fecondazione dei mammiferi 23 , 24 . Questi approcci hanno suscitato scintille di zinco strettamente coordinate con il primo transitorio di calcio ( Fig. 1D, E). È importante sottolineare che la scintilla di zinco è stata osservata anche quando solo l'esocitosi di zinco è stata monitorata con FluoZin-3 al momento dell'attivazione dell'uovo, indicando che il segnale non era un artefatto dell'imaging del calcio ( Fig. 1F, G ). Da notare che c'erano differenze nei profili di ampiezza della scintilla di zinco tra le singole uova sia tra che tra i singoli partecipanti, suggerendo differenze sottostanti nella qualità dei gameti ( Fig. 1H ). Siamo quindi in grado di segnalare che la scintilla di zinco si verifica durante l'attivazione dell'uovo umano ed è parallela al transitorio di calcio intracellulare.

Figura 1

La scintilla di zinco si verifica nelle uova umane mature in concerto con l'aumento del calcio intracellulare in risposta a vari metodi di attivazione delle uova.

( A ) Un montaggio rappresentativo del corso temporale delle risposte di attivazione di calcio e zinco osservate in un uovo MII umano dopo l'attivazione dell'uovo con 20 μM di Ca-ionomicina (Pt008a). Il calcio intracellulare è stato monitorato utilizzando 1 μM Fluo-4-AM e lo zinco extracellulare è stato monitorato utilizzando 50 μM FluoZin-3. Il segnale iniziale della scintilla di zinco è indicato dalla freccia bianca. La scala dei colori LUT è visualizzata in basso. ( B ) 

Per il montaggio viene mostrata una traccia temporale della fluorescenza normalizzata di calcio (nero) e zinco (verde) (F/F 0 ). ( C ) Grafico dell'ampiezza di Ca rispetto all'ampiezza di zinco nelle uova MII attivate (N = 9). L'analisi di regressione lineare indica una correlazione positiva tra i valori (R 2  = 0,633). ( d) Viene mostrata una traccia temporale della fluorescenza normalizzata di calcio (nero) e zinco (verde) (F/F 0 ) dopo l'attivazione dell'uovo con 20 μM di ionomicina (forma apo, senza Ca) (Pt045b). ( E ) Viene mostrata una traccia temporale della fluorescenza normalizzata di calcio (nero) e zinco (verde) (F/F0 ) dopo l'iniezione di hPLCζcRNA a 0,2 mg/ml (Pt057c). 

Due delle 5 uova attivate con successo con hPLCζ cRNA hanno mostrato una scintilla di zinco. Un asterisco evidenzia la scintilla di zinco che si verifica in concomitanza con il primo transitorio di calcio. ( F ) Un montaggio rappresentativo del corso temporale di un uovo MII attivato con 20 μM di Ca-ionomicina seguito dal solo monitoraggio dello zinco extracellulare utilizzando 50 μM di FluoZin-3 (Pt034a). ( g) Una traccia temporale della fluorescenza di zinco normalizzata (F/F 0 ) dopo l'attivazione dell'uovo con 20 μM di Ca-ionomicina è mostrata da Pt034a. ( H ) Un grafico dell'ampiezza dello zinco nelle uova MII attivate con 20 μM di Ca-ionomicina da un totale di 8 diversi partecipanti mostra la variazione delle scintille di zinco che si osserva tra le uova (N = 15).
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L'acquisizione del potenziale di scintilla di zinco dipende dallo stadio meiotico

Per determinare se la scintilla di zinco fosse un segno distintivo dei gameti competenti per la fecondazione, abbiamo confrontato i profili di scintilla di zinco degli ovociti della vescicola germinale (GV) immaturi arrestati in profase I (qui indicati come ovociti) con quelli delle uova mature (Fig . 2 , film S2 ). Per prima cosa abbiamo eseguito questo confronto monitorando lo zinco extracellulare durante il trattamento con Ca-ionomicina con campioni abbinati ai partecipanti (ovvero ovociti GV e uova MII dello stesso individuo) per ridurre al minimo le variabili di confusione. Usando questo approccio, abbiamo scoperto che l'ampiezza della scintilla di zinco era più alta nelle uova MII rispetto agli ovociti GV nei campioni di 4 dei 6 partecipanti ( Fig. 2A-C). 

In un sottogruppo di ovociti GV e uova MII di più partecipanti, abbiamo monitorato sia il calcio intracellulare che lo zinco extracellulare e abbiamo confrontato il rapporto tra l'ampiezza transitoria del calcio e l'ampiezza della scintilla di zinco ( Fig. 2D ). Il rapporto tra le intensità di fluorescenza di calcio: zinco fornisce una forte indicazione di quanto bene una cellula può rispondere agli aumenti del calcio intracellulare, con rapporti più piccoli corrispondenti a risposte di zinco più robuste. Abbiamo scoperto che le uova MII mostravano in media un rapporto inferiore rispetto agli ovociti GV, indicando che le scintille di zinco sono più prominenti rispetto ai transitori intracellulari di calcio nelle uova MII ( Fig. 2D ).

figura 2

L'acquisizione del potenziale di scintilla di zinco dipende dallo stadio meiotico.

( A ) Tracce temporali di fluorescenza di zinco normalizzata (F/F 0 ) e immagini di luce trasmessa di un ovocita GV arrestato in profase I e due uova arrestate in metafase II (MII) dallo stesso partecipante in seguito all'attivazione con 20 μM di Ca-ionomicina ( Pt017). 

Lo zinco extracellulare è stato monitorato utilizzando 50 μM di FluoZin-3. ( B ) Ulteriori tracce temporali di fluorescenza di zinco normalizzata (F/F 0 ) e ( C ) l'ampiezza della scintilla di zinco nei gameti GV (grigio) e MII (nero) attivati ​​con Ca-ionomicina è mostrata per 6 campioni abbinati ai partecipanti (N = 7 ovociti GV e N = 12 uova MII) ( C) Il confronto del rapporto tra il transitorio di Ca e l'ampiezza della scintilla di zinco nei gameti GV (N = 5) e MII (N = 11) mostra che le uova MII tendono ad avere un rapporto Ca/Zn inferiore rispetto agli ovociti GV (t-test, p<0,0001).
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Abbiamo ulteriormente confermato questi risultati nel topo ( Figura 1 supplementare ). Abbiamo raccolto ovociti GV e uova MII da topi stimolati con gonadotropina e monitorato l'esocitosi di zinco in risposta all'attivazione dell'uovo indotta da ionomicina in parallelo ( Figura 1 supplementare ). Abbiamo scoperto che, come è stato osservato nell'uomo, c'era una dipendenza dalla maturazione meiotica della capacità del gamete del topo di suscitare una scintilla di zinco dopo l'attivazione partenogenetica (Figura 1 supplementare ). Pertanto, tra le specie esaminate c'era una forte correlazione tra lo stadio meiotico e la risposta alla scintilla di zinco, con i gameti arrestati alla profase I che avevano in media una scintilla di zinco più piccola rispetto a quelli allo stadio metafase II.
La chelazione intracellulare dello zinco è sufficiente per indurre l'attivazione dell'uovo MII umano

Tre diversi metodi di attivazione partenogenetica (Ca-ionomicina, ionomicina e hPLCζ cRNA) hanno provocato l'esocitosi dello zinco, fornendo una forte evidenza che la scintilla di zinco è un segno distintivo molto precoce dell'attivazione dell'uovo. Per comprendere ulteriormente quale possa essere la funzione biologica di questa perdita di zinco nell'uomo, abbiamo imitato la perdita di zinco indotta dall'attivazione utilizzando il chelante specifico dello zinco, N, N, N ', N'-tetrakis (2-piridilmetil) etano- 1,2-diammina (TPEN) ( Fig. 3 ) 11 . Il trattamento delle uova MII con TPEN 50 μM ha perturbato lo zinco labile intracellulare, riducendolo a livelli non rilevabili come valutato mediante colorazione con il fluoroforo specifico per zinco Fluozin-3-AM ( Fig. 3A ). In confronto, i livelli di zinco labile sono rimasti simili nelle uova MII trattate con DMSO ( Fig. 3A, inserti). Abbiamo scoperto che l'insufficienza di zinco indotta dal solo TPEN ha provocato l'attivazione dell'uovo MII. Entro 3 ore, il 100% delle uova MII umane trattate con TPEN aveva completato la meiosi II ed era entrato nel ciclo cellulare mitotico come evidenziato dall'aspetto a rete della rete del citoscheletro dei microtubuli che è caratteristica dell'interfase mitotica (Fig. 3B ) . 

Al contrario, tutte le uova MII umane trattate con DMSO sono rimaste arrestate nella meiosi II come evidenziato dalla presenza del fuso meiotico ( Fig. 3B ). Pertanto, questi dati suggeriscono che l'abbassamento della disponibilità di zinco intracellulare induce la transizione del ciclo cellulare dalla meiosi alla mitosi, un primo passo essenziale nella transizione dall'uovo all'embrione del MII umano o, in questo caso, la partenogenesi.

Figura 3

La chelazione dello zinco è sufficiente per indurre l'attivazione dell'uovo umano.

( A ) I livelli e la localizzazione di Zn labili intracellulari sono stati rilevati utilizzando Fluozin3-AM nelle uova MII prima (a) e dopo (b) il trattamento con 50 μM di TPEN. 

Gli inserti mostrano zinco labile intracellulare nelle uova MII di controllo trattate con DMSO allo 0,5%. ( B ) L'immunocitochimica per i componenti del citoscheletro (actina; rosso e tubulina; verde) è stata eseguita dopo il trattamento con DMSO (a-c; N = 3) o TPEN (d-f; N = 4). 

Le uova trattate con DMSO hanno mantenuto il loro arresto MII come evidenziato da fusi intatti mentre le uova trattate con TPEN avevano attivato e completato la meiosi come evidenziato da una rete di tubulina interfasica.

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Discussione

Qui estendiamo il nostro precedente lavoro nel topo e nel primato non umano e documentiamo, per la prima volta nell'uomo, che l'esocitosi dello zinco è associata all'attivazione dell'uovo e che una riduzione dello zinco è sufficiente per innescare la ripresa del ciclo cellulare 10 , 11 . 

A causa delle restrizioni legali sulla ricerca con ovuli umani, ci siamo limitati ai metodi di attivazione partenogenetica per interrogare la scintilla di zinco. Dei metodi che abbiamo usato, l'iniezione di hPLCζ cRNA è l'approccio fisiologicamente più rilevante in quanto induce una serie di transitori di calcio simili all'attivazione indotta dallo sperma 24 , 25 . Questo metodo ha prodotto scintille di zinco e nel topo abbiamo catturato la scintilla di zinco mediata dallo sperma in tempo reale durante in vitrofecondazione. Questi risultati supportano fortemente il significato fisiologico di questo evento biologico (Zhang et al. , Sci Reports, accettato). Durante i nostri studi sia nel topo che nell'uomo, abbiamo notato che c'era un'acquisizione dipendente dalla maturazione meiotica della capacità del gamete di montare una scintilla di zinco, con cellule arrestate alla profase I che avevano in media una scintilla di zinco più piccola rispetto a quelle arrestate a metafase II. 

Questi risultati suggeriscono che il meccanismo che suscita la scintilla di zinco probabilmente non è completamente stabilito fino a poco prima della fecondazione, il che potrebbe essere un meccanismo importante per prevenire l'attivazione prematura dell'uovo. 

Nel topo si verifica un aumento significativo dello zinco intracellulare durante la maturazione meiotica che è regolata prevalentemente dai trasportatori di zinco ZIP6 e ZIP10 13. Inoltre, un'importante polarizzazione della distribuzione delle vescicole corticali si verifica anche nel gamete tra la profase I e la metafase II e queste vescicole sono la fonte della scintilla di zinco 16 . Pertanto, sembra esserci una regolazione spazio-temporale della capacità del gamete di produrre una scintilla di zinco, che è probabile che sia conservata poiché il gamete umano esprime sia ZIP6 che ZIP10 e ha zinco labile localizzato per punteggiare strutture simili a vescicole 13 .


Questo stretto coordinamento tra l'acquisizione della capacità di scintilla di zinco e la tempistica dell'attivazione dell'uovo è parallelo a quanto osservato con l'esocitosi dei granuli corticali (CGE) e i transitori di calcio. Ad esempio, i granuli corticali sono strutture secretorie che contengono proteasi che scindono la zona pellucida glicoproteina 2 e sono coinvolte nello stabilire il blocco della polispermia. I gameti arrestati alla profase I sono meno competenti delle uova MII mature a subire CGE, anche se stimolati con trattamenti che inducono transitori di calcio che imitano ciò che si verifica durante la fecondazione 26. Sia la CGE che l'esocitosi dello zinco sono eventi dipendenti dal calcio, quindi i nostri risultati sono coerenti con la consapevolezza che la capacità dell'uovo di suscitare transitori ripetitivi di calcio aumenta anche durante la progressione meiotica. 

Gli ovociti GV, ad esempio, non sono in grado di avviare e mantenere i transitori di calcio con la stessa efficienza delle uova MII 27 , 28 . In risposta alla ionomicina, le uova MII di topo mostrano una risposta al calcio significativamente maggiore rispetto agli ovociti GV e il cambiamento maggiore è stato osservato tra la metafase della meiosi I e MII 29. Questa risposta transitoria differenziale del calcio è dovuta ai cambiamenti associati alla maturazione meiotica nei meccanismi dell'omeostasi del calcio, comprese le modificazioni e la densità dei canali del calcio, la riorganizzazione del reticolo endoplasmatico (ER) e l'aumento delle riserve di calcio dell'ER30 . Anticipiamo quindi che l'acquisizione del potenziale di scintilla dello zinco rispecchierà quanto già dimostrato per il calcio 29 . Tuttavia, sono giustificati studi futuri per definire i tempi precisi durante la maturazione meiotica quando il gamete è in grado di ottenere una risposta massima alla scintilla di zinco.


Sebbene sia gli ovociti GV di topo che quelli umani avessero una capacità significativamente ridotta di produrre una scintilla di zinco in risposta all'attivazione della ionomicina rispetto alle uova MII, la risposta degli ovociti GV di topo in generale era più uniforme e attenuata rispetto agli ovociti GV umani. Questa discrepanza può riflettere differenze specie-specifiche nel meccanismo del calcio e nei meccanismi di segnalazione. Ad esempio, gli ovociti GV di criceto contengono già circa l'80% delle riserve di calcio sensibili all'IP3 presenti nelle uova MII 31. In alternativa, non possiamo scartare la possibilità che possano esserci differenze intrinseche nella qualità del topo e dei gameti umani. Ad esempio, gli ovociti GV del topo sono stati ottenuti seguendo i protocolli di stimolazione della gonadotropina che arricchiscono per una popolazione sincrona di ovociti completamente cresciuti, mentre gli ovociti GV umani sono stati ottenuti perché non sono riusciti a riprendere la meiosi dopo l'iperstimolazione e sono probabilmente di qualità più varia. 

Questa possibilità sottolinea le sfide intrinseche della conduzione della ricerca di base sui gameti umani, vale a dire che la maggior parte degli ovociti sono quelli scartati dai cicli di tecnologie di riproduzione assistita (ART) perché non soddisfano i criteri di sviluppo e/o morfologici per l'uso clinico e che il la dimensione del campione è limitata. Nonostante queste sfide,32,33,34.


Il lavoro qui descritto, oltre a fornire nuove informazioni sulla biologia fondamentale dell'uovo umano, ha anche un importante impatto traslazionale per l'ART in due modi distinti. In primo luogo, l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI), il processo in cui uno spermatozoo viene microiniettato direttamente nell'ovulo, è stato originariamente sviluppato per superare l'infertilità del fattore maschile, ma ora rappresenta circa il 70% delle procedure eseguite nell'ART clinica ( www.sart . org ). Sebbene l'ICSI si traduca in una fecondazione riuscita circa il 70% delle volte, il fallimento completo della fecondazione si verifica ancora fino al 5% dei casi a causa dell'incapacità dell'ovulo di attivarsi correttamente .. Per migliorare il successo dell'ICSI nei pazienti con basso potenziale di fecondazione, sono stati implementati clinicamente metodi che combinano l'ICSI e l'attivazione dell'uovo. Questa tecnica, denominata Assisted Oocyte Activation (AOA), si basa su approcci che imitano o inducono l'aumento del calcio intracellulare indotto dalla fecondazione come lo ionoforo di calcio o PLCζ 23 , 25 . Sono state segnalate gravidanze riuscite utilizzando AOA 35 . Abbiamo dimostrato che il trattamento con un chelante di zinco intracellulare può attivare le uova umane e quindi può avere importanti applicazioni nell'AOA. Nel topo, la scintilla di zinco indotta dalla fecondazione, a differenza dei transitori di calcio, è limitata ai primi minuti di attivazione dell'uovo (Zhang et al., Sci Reports, accettato). A causa di questa finestra ristretta, la riduzione della disponibilità di zinco intracellulare può essere un approccio più mirato e specifico per guidare l'attivazione dell'uovo e può quindi aumentare l'efficacia dell'AOA. 

È importante sottolineare che l'AOA mediata da TPEN ha prodotto una progenie viva sana in modelli murini e suini 14 , 17 .


In secondo luogo, i progressi nella comprensione dei ruoli fisico-chimici dello zinco nella funzione dei gameti possono avere un impatto clinico perché la scintilla di zinco si verifica rapidamente dopo l'attivazione dell'uovo nell'uovo umano e può essere rilevata nello spazio extracellulare. Inoltre, ci sono variazioni nei profili transitori sia della scintilla di zinco che del calcio tra le singole uova che suggeriscono differenze di qualità sottostanti. Infatti, eleganti studi sull'uomo hanno dimostrato che i profili transitori di calcio che seguono l'attivazione dell'uovo indotta dallo sperma sono distinti a seconda dei parametri di qualità dell'uovo 4 . Ad esempio, processi noti per diminuire la qualità dei gameti, anche in vitromaturazione, coltura estesa, vitrificazione e scongelamento, tutti determinano alterazioni della frequenza e dell'ampiezza dei transitori di calcio durante la fecondazione 4 . Nell'uomo non è stato possibile stabilire una relazione diretta tra la dinamica dello zinco durante la fecondazione e l'ulteriore sviluppo embrionale. Per colmare questa importante lacuna di conoscenza, abbiamo dimostrato nel topo che i parametri della prima scintilla di zinco (ampiezza e rilascio totale di zinco) sono altamente associati a blastocisti di maggiore qualità (Zhang et al., Sci Reports, accettato). Sono attualmente in corso sforzi per sviluppare piattaforme per rilevare e quantificare la scintilla di zinco umana in modo non invasivo, sicuro ed efficace. 

In particolare, sono necessari metodi con cui è possibile misurare lo zinco esocitato nei media dopo la fecondazione per limitare l'esposizione dello zigote sia ai coloranti che ai fotoni dannosi necessari per l'imaging. La tecnologia della scintilla di zinco possiede diversi vantaggi rispetto ai metodi di selezione degli embrioni esistenti poiché questo fenomeno biologico si verifica a livello extracellulare entro pochi minuti dalla fecondazione e specifici profili di scintilla di zinco sono fortemente correlati e sono predittivi dello sviluppo dell'embrione preimpianto (Zhang et al ., Sci Reports, accettato). Pertanto, la selezione degli embrioni in base al loro profilo di scintilla di zinco indotto dalla fecondazione ridurrebbe al minimo la necessità di una coltura estesa dell'embrione e del trasferimento multiplo di embrioni, entrambi con rischi misurabili 36 , 37 , 38 , 39 . 

Tali modifiche migliorerebbero i risultati riproduttivi per l'ART, che ora rappresentano milioni di nascite in tutto il mondo.


Materiali e metodi


Acquisizione di gameti umani


I gameti femminili utilizzati per gli esperimenti di attivazione delle uova sono stati ottenuti esclusivamente dal Fertility Center of Illinois (FCI) e tutti gli aspetti di questi studi di attivazione delle uova sono stati condotti in conformità con le linee guida dell'Institutional Review Board (IRB) della Northwestern University e sotto l'approvazione dell'IRB. Abbiamo reclutato partecipanti sottoposti a iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) per il trattamento dell'infertilità programmato e dopo il consenso informato scritto, abbiamo raccolto gameti femminili immaturi che altrimenti sarebbero stati scartati come pratica di routine. Alla FCI, solo gli ovociti che si trovano allo stadio MII entro 2 ore dal prelievo vengono utilizzati clinicamente per l'inseminazione e tutte le altre cellule immature vengono scartate. Abbiamo ottenuto questo materiale scartato nel laboratorio di ricerca circa 3-5 ore dopo il recupero.


All'arrivo nel nostro laboratorio di ricerca, i campioni di gameti sono stati etichettati con l'ID partecipante corrispondente (Pt00X) e ciascun gamete è stato valutato mediante microscopia ottica. Solo le cellule morfologicamente normali che si trovavano nella fase meiotica corretta sono state utilizzate per esperimenti a valle che coinvolgono l'attivazione dell'uovo e l'imaging di cellule vive. La dimensione del campione era quindi limitata dalla disponibilità di partecipanti che soddisfacevano rigorosamente i criteri di selezione (donne, ≥18 anni, di lingua inglese, sottoposte a trattamento IVF-ICSI per una diagnosi non cancerosa e che firmavano il documento di consenso informato) e dalla qualità del i loro gameti. Al ricevimento, il 33% delle cellule è stato arrestato in profase della meiosi I come evidenziato da una vescicola germinale (GV) intatta, il 30% aveva ripreso la meiosi ma non aveva raggiunto la metafase della meiosi II (MII), il 22% aveva raggiunto MII e il 15% erano degenerati (Figura 2A supplementare ). Le cellule sono state utilizzate immediatamente o sono state ulteriormente maturate in vitro fino allo stadio MII. 

È importante sottolineare che, per gli esperimenti che richiedevano ovociti GV ( Fig. 2 ), le cellule in questa fase meiotica sono state utilizzate immediatamente all'arrivo e non sono state sottoposte a ulteriore maturazione in vitro (IVM). Per IVM, i gameti sono stati collocati in terreno SAGE IVM (Origio) che era stato pre-equilibrato in piastre da 4 pozzetti a 37 °C in 5% CO 2 . Le cellule che erano nella fase GV-intact all'arrivo hanno impiegato 28,0 ± 6,8 ore per raggiungere MII, mentre quelle che avevano subito GVBD già all'arrivo hanno impiegato solo 15,8 ± 9,7 ore. In genere, l'ovocita umano impiega 36-42 ore per raggiungere MII dopo IVM 32. Pertanto, sulla base di questa tempistica, le cellule che abbiamo utilizzato nel nostro studio erano in gran parte meioticamente competenti e avevano ripreso la meiosi mentre erano ancora nell'ovaio, ma erano semplicemente all'estremità ritardata della distribuzione. Tutte le cellule utilizzate in questo studio avevano una morfologia cellulare e subcellulare apparentemente normale come valutato dall'analisi del citoscheletro ( Figura 2B supplementare ). I trattamenti sperimentali sono stati testati in cellule da un minimo di tre partecipanti separati. Tutti i dati sono stati inclusi in questo studio come descritto.
Cura e benessere degli animali


Gli animali utilizzati in questo studio sono stati gestiti seguendo le linee guida per la cura e il benessere degli animali del Consiglio nazionale delle ricerche. 

Queste procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Northwestern University. Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida approvate.
Prodotti chimici e reagenti


Indicatori fluorescenti (FluoZin-3, FluoZin-3-AM, Fluo-4-AM), ionomicina, Ca-ionomicina e acido pluronico sono stati ottenuti da Life Technologies (Grand Island, NY). Acetato di ammonio, ionomicina, Ca-ionomicina e altri prodotti chimici sono stati acquistati da Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Ionomicina e Ca-ionomicina sono state conservate come aliquote monouso in DMSO a -20 ° C. Il TPEN è stato sciolto in DMSO immediatamente prima di ogni utilizzo ed è stato diluito in tampone in modo tale che i tamponi contenessero ≤0,5% di DMSO. La paraformaldeide è stata acquistata da Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA).
Microscopia a fluorescenza cellulare viva dell'attivazione dell'uovo MII mediante ionoforo


Negli esperimenti di imaging solo Zn, i singoli gameti sono stati posizionati su un'estremità di una goccia lunga e poco profonda di 19 μL di FluoZin-3 50 μM (per il monitoraggio di Zn) in terreno hCZB privo di Ca sotto olio in un piatto di imaging con fondo coprioggetto. Negli esperimenti in cui sono stati monitorati il ​​Ca intracellulare e lo Zn extracellulare, i gameti sono stati prima incubati in 1 μM di Fluo4-AM (per il monitoraggio del Ca) e 0,02% di Pluronic F-127 nel mezzo di lavaggio degli ovociti SAGE (Origio) per 30 minuti a 37 °C 40. I gameti sono stati quindi lavati attraverso un mezzo privo di coloranti e posti in 50 μM di FluoZin-3 in hCZB senza Ca come descritto sopra. L'imaging è stato eseguito a 37 ° C su un microscopio confocale TCS SP5 utilizzando un'eccitazione a 488 nm e un foro stenopeico aperto (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL). 

Le immagini di fluorescenza iniziali sono state ottenute prima dell'attivazione. Per l'imaging di attivazione, la Ca-ionomicina (1 μL) è stata introdotta nella goccia di imaging all'estremità opposta a quella del gamete per produrre una concentrazione finale di 20 μM. L'imaging è stato avviato immediatamente dopo l'aggiunta di Ca-ionomicina. Per indurre l'attivazione dell'uovo attraverso riserve di calcio endogeno, 20 μM di ionomicina (forma apo, senza Ca) è stata aggiunta alla goccia di imaging come descritto sopra. Le immagini sono state raccolte ogni 2 secondi per un minimo di 5 minuti come descritto sopra.41 . Le ROI intracellulari sono state definite come l'intera area interna della cella. Le ROI extracellulari sono state definite come un anello attorno al perimetro della cella. Lo spessore dell'anello è stato conservato per tutte le analisi dei dati.
Microscopia a fluorescenza di cellule vive dell'attivazione dell'uovo MII mediante microiniezione di cRNA hPLCζ


Il plasmide pBluescript RN3 contenente la sequenza codificante a lunghezza intera del PLCζ umano (dono generoso del Dr. Rafael Fissore, Università del Massachusetts-Amherst) è stato linearizzato in un sito oltre l'estremità 3' della sequenza codificante e in vitrotrascritto utilizzando il kit T3 mMessage mMachine (Ambion, Austin, TX). L'mRNA è stato purificato secondo le istruzioni del produttore. Prima della microiniezione, il cRNA concentrato (2 mg/ml) è stato riscaldato per 3 minuti a 85 °C per ridurre la struttura secondaria e diluito secondo necessità in acqua priva di nucleasi. hPLCζ cRNA è stato microiniettato nel citoplasma delle concentrazioni finali di uova umane di 0,05 mg/ml e 0,2 mg/ml. Per le microiniezioni, le uova umane sono state prima incubate in 1μM Fluo4-AM e 0,02% Pluronic F-127 nel mezzo di lavaggio degli ovociti SAGE (Origio) per 30 minuti a 37 ° C. Le uova sono state quindi microiniettate con hPLCζ cRNA. 

Per la microiniezione, le uova MII umane sono state trasferite in gocce di terreno L-15 contenente lo 0,05% (p/v) di alcol polivinilico e lo 0,1% (p/v) di saccarosio (Invitrogen) sotto olio minerale leggero su un palco riscaldato a 37 °C . hPLCζ cRNA è stato caricato in micropipette di vetro e consegnato da un microiniettore digitale XenoWorks (Sutter Instrument, Novato, CA). Il volume di iniezione era di ~ 28-48 pl (1-3% del volume totale dell'uovo). 

Le uova sono state quindi lavate attraverso un terreno privo di coloranti e poste in 50 μM di FluoZin-3 in hCZB come descritto sopra.
Chelazione dello zinco e analisi dello zinco labile


Per analizzare se il trattamento con TPEN ha perturbato il contenuto di zinco intracellulare, le uova umane sono state prima caricate con 10 μM di Fluozin3-AM integrato con acido pluronico allo 0,02% per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi le uova sono state incubate in terreno CZB (Millipore, Temecula, CA) contenente DMSO allo 0,5% con o senza TPEN da 50 μM per 30 min a 37 °C in un'atmosfera con il 5% di CO 2 nell'aria. Le uova sono state quindi riprese a 37 ° C su un microscopio confocale TCS SP5 utilizzando un'eccitazione a 488 nm e un foro stenopeico aperto (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL). Per determinare l'effetto della chelazione dello zinco sulla progressione del ciclo cellulare, le uova MII umane sono state incubate in terreno CZB (Millipore, Temecula, CA) contenente 0,1% PVA con o senza 50 μM TPEN e coltivate per 2 ore a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2in aria. Il TPEN è stato appena preparato in DMSO a una concentrazione di stock di 10 mM. Il mezzo di controllo conteneva lo 0,5% di DMSO per ottenere la stessa concentrazione di DMSO delle gocce di TPEN. Le uova sono state quindi trasferite nel terreno KSOM (Millipore) e coltivate per altre 3 ore. La coltura estesa dopo l'attivazione partenogenetica non è stata possibile a causa delle specifiche nel nostro protocollo IRB. Dopo la coltura, le cellule sono state fissate e processate per l'immunofluorescenza come descritto di seguito per confermare la fase del ciclo cellulare.
Immunofluorescenza e microscopia


Per la caratterizzazione del citoscheletro (actina e tubulina), le cellule sono state fissate in 3,8% PFA 0,1% Triton-X in PBS a 37 ° C per 1 ora. Le cellule sono state trasferite in tampone bloccante (0,01% Tween 20, 0,01% NaN 3 , 3 mg/mL BSA, PBS) e conservate a 4 °C prima della colorazione. I campioni sono stati permeabilizzati in Triton-X allo 0,1% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente, lavati in tampone bloccante e incubati in 1:100 tubulina-FITC (Cell Signaling, Beverly, MA) e 1:50 rodamina falloidina (Life Technologies) durante la notte a 4°C. 

I campioni sono stati quindi lavati 3 × 30 minuti in tampone bloccante e montati su vetrini utilizzando Vectashield® ( Vector Labs, Burlingame, CA). La fluorescenza FITC e rodamina è stata rilevata utilizzando un microscopio confocale TCS SP5 (Leica) utilizzando rispettivamente l'eccitazione laser a 488 nm e 543 nm.
analisi statistica


La risposta alla scintilla di zinco nei gameti immaturi e maturi è stata confrontata utilizzando un t-test spaiato a due code. I test statistici sono stati eseguiti utilizzando il software Prism 5.0 (GraphPad). P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.


Informazioni aggiuntive




Come citare questo articolo : Duncan, FE et al. La scintilla di zinco è una firma inorganica dell'attivazione dell'uovo umano. Sci. Rep. 6 , 24737; doi: 10.1038/srep24737 (2016).




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Ringraziamenti




Riconosciamo S. Jasulaitis (FCI) e J. Hirshfield-Cytron (FCI) per il coordinamento del campione di ricerca clinica. Ringraziamo i team di embriologia della FCI (J. Mathews, E. Pelts e J. Liebermann) per la raccolta dei gameti umani. Ringraziamo anche S. Banuvar, J. Pahnke e A. Gunn per il supporto normativo e di conformità. Per rispettare la legge degli Stati Uniti relativa alla ricerca sui partenoti umani, abbiamo utilizzato fonti di finanziamento non federali. Questo lavoro è stato sostenuto dal Thomas J. Watkins Endowment (TKW) e da una borsa di ricerca della Ferring Pharmaceuticals (TKW). Tutti gli studi di attivazione delle uova MII sono stati eseguiti esclusivamente con campioni della FCI e fondi della Ferring Pharmaceuticals.


Informazioni sull'autore
Note dell'autore


Duncan Francesca E., Que Emily L. e Zhang Nan hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.
Autori e affiliazioni


Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, Chicago, 60611, IL, USA


Francesca E. Duncan, Nan Zhang & Teresa K. Woodruff




Istituto di chimica dei processi vitali, Northwestern University, Evanston, 60208, IL, USA


Emily L. Que e Thomas V. O'Halloran




Fertility Centers of Illinois, Chicago, 60610, IL, USA


Eva C. Feinberg




Dipartimento di Chimica e Dipartimento di Bioscienze Molecolari, Northwestern University, Evanston, 60208, IL, USA


Thomas V. O'Halloran
Contributi


Tutti gli autori hanno contribuito ampiamente al lavoro presentato in questo documento. FED, ELQ e NZ hanno progettato tutti gli esperimenti, eseguito esperimenti, analizzato i dati e scritto il manoscritto. ECF ha fornito competenze cliniche e ha gestito l'acquisizione di campioni umani. TVO e TKW hanno supervisionato la ricerca, discusso i risultati in tutte le fasi e curato il manoscritto.


Dichiarazioni etiche


Interessi conflittuali


Questo progetto è stato finanziato da una sovvenzione illimitata di Ferring Pharmaceuticals.


Fonte: https://www.nature.com/articles/srep24737#rightslink